返回列表综上所述★ღღღ，目前EV分离的方法多种多样★ღღღ。但是★ღღღ，每种方法都有其优点和缺点ku酷游平台★ღღღ。无论采用何种方法★ღღღ，重要的是考虑分离的EV是否完整★ღღღ，以及是否可以通过结合不同的技术来优化分离和纯化★ღღღ。
EV在复杂的体液环境中体积小★ღღღ、密度低★ღღღ、分布广★ღღღ，使得研究人员在分离和分析后获得高纯度EV极具挑战性★ღღღ。这也限制了它们的临床应用★ღღღ。现在已经开发了几种新技术和商业产品来隔离EV★ღღღ。这些基于利用EV物理特性的分离原理★ღღღ，例如它们的密度★ღღღ、质量和形状★ღღღ。此外★ღღღ，还可以根据EV的理化和生化特性进行分离★ღღღ，例如电荷★ღღღ、流体动力学★ღღღ、溶解度和表面特性（蛋白质）★ღღღ。已经开发了几种常规分离方法★ღღღ，每种方法都有自己的优点和缺点★ღღღ。因此★ღღღ，根据EV的不同特性★ღღღ，可以以单一或组合的方式进行分离★ღღღ。
超速离心（UC）是最常用的方法★ღღღ，也是目前EVs分离的金标准★ღღღ。在这种方法中★ღღღ，EV被分离★ღღღ，因为它们的沉降系数与其他颗粒的沉降系数不同★ღღღ。简而言之★ღღღ，UC是一种差速离心方法★ღღღ，其中离心力逐渐增加★ღღღ，首先以2000-4000×g的低离心力去除死细胞和细胞碎片;去除凋亡囊泡★ღღღ、MV★ღღღ、生物聚合物等★ღღღ，浓度为10000-20000×g;并以10×g的高离心力沉淀外泌体★ღღღ。使用UC分离毛囊和脂肪组织间充质干细胞衍生的EV★ღღღ。在研究中★ღღღ，首先收集含有培养基的细胞★ღღღ，然后在2000×g和4°C下离心10分钟以除去细胞碎片★ღღღ，然后将上清液以10000×g离心30分钟★ღღღ。最后★ღღღ，使用第二上清液在以100000×g离心90分钟后获得EV★ღღღ。利用UC从前列腺癌细胞和正常前列腺上皮细胞中提取外泌体★ღღღ，他们开发了一种3D-SiO2多孔芯片用于小鼠肿瘤分期和前列腺癌的早期临床检测★ღღღ。然而★ღღღ，离心参数例如使用振荡桶或固定角度转子以及离心持续时间★ღღღ，会影响分离囊泡的产量和纯度★ღღღ。结果表明★ღღღ，适当延长离心时间可以提高外泌体中的蛋白质和RNA产量★ღღღ，而仅靠转速无法预测外泌体的造丸能力★ღღღ。
此外★ღღღ，UC会由于高离心力而对囊泡造成机械损伤★ღღღ，从而导致囊泡与实底血管之间的碰撞★ღღღ。这会降低分离外泌体的纯度★ღღღ，并由于囊泡异质性导致存在一些污染物蛋白质聚集体★ღღღ。
密度梯度离心（DGC）是一种基于EV尺寸★ღღღ、形状★ღღღ、质量和密度的改进超速离心方法★ღღღ。在密度梯度溶液中★ღღღ，当每个颗粒的离心力与浮力平衡时★ღღღ，由于密度不同★ღღღ，不同的组分在从上到下的梯度中积累在不同位置★ღღღ。因此★ღღღ，外泌体可以与样品中的其他成分分离★ღღღ。通常★ღღღ，蔗糖或碘二醇用于产生密度梯度★ღღღ。使用差速离心和额外的Optiprep™密度梯度超速离心提取水蚤原始小胶质细胞释放的EV668论坛★ღღღ。使用质谱法测定了分离的EV的蛋白质含量★ღღღ，发现DGC的使用消除了污染物★ღღღ，并限制了分离过程中存在的蛋白质聚集体和其他膜颗粒的共分离效果★ღღღ。使用DGC从人类唾液中分离EV★ღღღ，并将其与从细胞培养上清液中分离的EV进行比较★ღღღ。他们发现唾液EV的体积和密度分别为47.8±12.3nm和1.11g/mL★ღღღ，而细胞EV的体积和密度分别为74±23.5nm和1.06g/mL★ღღღ。因此★ღღღ，唾液EV的体积较低★ღღღ，密度较高★ღღღ。
DGC需要跨不同梯度的分离★ღღღ，并且需要时间在梯度中的每个点达到平衡★ღღღ。因此★ღღღ，此过程相对耗时且时间敏感★ღღღ，但操作相对简单★ღღღ。
体积排阻色谱（SEC）是一种基于粒径差异的分离技术★ღღღ。它也被称为凝胶过滤★ღღღ。色谱柱中的固定相由多孔珠（例如ku酷游平台★ღღღ，琼脂糖★ღღღ、琼脂糖★ღღღ、琼脂丙烯酸和Biogel P）组成★ღღღ。当添加样品时★ღღღ，大颗粒无法进入孔隙并被洗脱出来★ღღღ，在色谱柱中保留的时间较短★ღღღ。同时★ღღღ，小颗粒进入孔隙★ღღღ，其洗脱速率显着降低★ღღღ。因此★ღღღ，实现了分离★ღღღ。如何使用SEC从不同的生物体液中分离EV★ღღღ。注射器或带有过滤器的空柱可用于设置SEC★ღღღ，同时在注射器的尖端放置尼龙网★ღღღ。随后可以添加缓冲液以润湿过滤器并防止气泡ku酷游平台★ღღღ。随后★ღღღ，可以加入所需体积的凝胶过滤基质★ღღღ、填充洗脱缓冲液★ღღღ、润湿★ღღღ，最后使用★ღღღ。使用SEC从人体滑液中分离EV★ღღღ，并证明SEC可以通过超速离心耗尽EV浓缩后残留的污染物★ღღღ。此外668论坛★ღღღ，使用高分辨率质谱分析★ღღღ，他们发现蛋白酶K成功去除纤连蛋白和其他细胞外蛋白★ღღღ。由于脂蛋白颗粒的存在★ღღღ，很难从血液中分离EV★ღღღ。因此★ღღღ，将SEC与密度缓冲相结合★ღღღ，将脂蛋白颗粒与EV分离★ღღღ，同时将脂蛋白颗粒的污染减少100倍★ღღღ，从而提高EV的纯度★ღღღ。比较了SEC和UC从尿液中提取外泌体方面★ღღღ，发现SEC在回收外泌体颗粒和蛋白质方面优于UC★ღღღ，提取的外泌体更多★ღღღ。相反★ღღღ，在UC过程中★ღღღ，发生破裂和不完全沉淀★ღღღ，导致外泌体蛋白回收率降低★ღღღ，外泌体颗粒明显损失★ღღღ。将SEC纯化的外泌体与EA.hy926和HCV29细胞系的外泌体进行比较★ღღღ，在共孵育后4-6小时显示出较高的内化能力★ღღღ。
因此★ღღღ，与用UC提取的EV相比668论坛★ღღღ，使用SEC提取的EV具有更高的纯度★ღღღ。然而★ღღღ，SEC在操作上更具挑战性★ღღღ，需要额外的设备★ღღღ。
超滤（UF）的原理基于分子大小★ღღღ。该过程类似于传统的过滤方法★ღღღ，因为较大的颗粒被过滤器保留★ღღღ，而较小的颗粒通过一个或多个具有不同孔径或MWCO（分子量截止值）的膜★ღღღ。切向流过滤（TFF）也基于这一原理★ღღღ，是UF的高级形式★ღღღ。使用TFF从微藻中分离EV★ღღღ，截止值为650★ღღღ、200和20nm★ღღღ。为了提高样品纯度和产量★ღღღ，评估了不同的技术参数和条件★ღღღ，以提高EVs的分离★ღღღ。发现优化的基于TFF的生物工艺适用于大规模生产★ღღღ。比较了UC和TFF从MDA-MB-231乳腺癌细胞培养物中分离EV的情况★ღღღ。发现TFF在产量和去除单个大分子和聚集体方面更胜一筹★ღღღ。开发了一种优化UF的方法★ღღღ，方法是引入0.22μm过滤器和MWCO为10000 kDa的透析膜★ღღღ，以去除大于200nm的细胞外微泡★ღღღ。使用离心超滤和100kDa MWCO纳米膜过滤装置从支气管肺泡灌洗液中分离EVs★ღღღ，发现该过程提供的EV分布比UC和DGC更小★ღღღ，更均匀★ღღღ。与UC相比★ღღღ，UF和SEC将每毫升培养基回收小型EV的能力提高了约400倍★ღღღ。
用于场流分馏的分离装置是一个薄而扁平的通道★ღღღ，高度为50–500μm★ღღღ。在垂直于样品流的方向上施加力场★ღღღ，随后聚焦在通道壁的一侧★ღღღ，其中颗粒由于其不同的尺寸而与壁保持不同的距离★ღღღ。离侧壁较远的较小颗粒在较大颗粒之前被洗脱★ღღღ。有不同类型的外部场★ღღღ，如电场★ღღღ、重力场★ღღღ、温度场和错流场★ღღღ，它们可用于根据其生物物理特性分离样品★ღღღ。其中★ღღღ，研究最广泛的是非对称流场分馏（AF4）中的错流场★ღღღ。AF4可用于从人血浆中的高密度脂蛋白（HDL）和脂蛋白颗粒（LDL）中分离EV★ღღღ，具有高纯度和重现性★ღღღ。此外★ღღღ，他们发现人EV在人血浆中的浓度高于等体积的配对血清样品ku酷游平台★ღღღ，并且人血浆中EV量的个体差异与年龄和性别无关★ღღღ。最后★ღღღ，他们优化了AF4技术和样品制备工艺参数★ღღღ。使用流场-流分馏法根据Hb1.F3永生化人类神经干细胞（HMSC）的不同流体动力学直径从Hb.F中分离浓缩外泌体★ღღღ。采用流场流分级法根据尿外泌体的大小进行分离★ღღღ，发现前列腺癌患者的外泌体几乎是健康个体的两倍★ღღღ。
然而★ღღღ，在该方法中★ღღღ，分离过程中的样品量很小★ღღღ，因此不允许进行大规模的分离和提取★ღღღ。此外★ღღღ，还需要事先分馏和浓缩★ღღღ。然而★ღღღ，该技术具有很高的重现性和分辨率★ღღღ。
聚合物沉淀法涉及将相关生物流体与聚合物溶液混合★ღღღ，然后低速离心以促进外泌体沉淀并获得外泌体★ღღღ。加入不同分子量的50%聚乙二醇（PEG）★ღღღ，使最终浓度达到6★ღღღ、8★ღღღ、10★ღღღ、12和15%PEG和75mM NaCl★ღღღ。在优化方法后★ღღღ，最终选择添加PEG6000和NaCl★ღღღ，以达到10%PEG和75mM NaCl的浓度★ღღღ。孵育8小时后★ღღღ，可除去大量牛血清蛋白★ღღღ。然而★ღღღ，研究表明★ღღღ，用PEG制备的EV样品仍可能保留一定比例的非EV相关分子★ღღღ。在SEC步骤之前使用PEG从细胞培养基中沉淀外泌体可以提高常规SEC方法的分辨率668论坛★ღღღ，因为PEG会沉淀可溶性蛋白质★ღღღ。此外★ღღღ，基于聚合物的沉淀与SEC（Pre-SEC）方法相结合可以帮助分离分泌EV亚型的单个细胞类型★ღღღ。如今★ღღღ，基于聚合物共沉淀的商用试剂盒可用于EV分离★ღღღ。使用miRCURY™外泌体分离试剂盒从血浆中获得丰富的EVs特异性miRNA★ღღღ。他们发现基于沉淀的方法不足以从血浆中纯化含有EVs的miRNA货物★ღღღ。虽然可以去除部分无囊泡miRNA668论坛★ღღღ，但无囊泡miRNA在该方法分离的血浆EV沉淀物中仍然占主导地位★ღღღ。比较了UC★ღღღ、PEG方法和两种商业试剂盒（Exoquick和PureExo）从健康供体血液中分离gDNA-EV的性能★ღღღ。他们发现PEG方法可以提高gDNA产量★ღღღ，降低成本和时间★ღღღ。
除了基于聚合物的沉淀外★ღღღ，基于电荷的沉淀还可用于EV分离★ღღღ。使用带正电荷的鱼精子蛋白诱导血清★ღღღ、唾液和细胞上清液中的EV沉淀★ღღღ。当使用35000Da PEG沉淀鱼精子蛋白时★ღღღ，促进了EV的重悬★ღღღ，并且沉淀EV的回收率比通过使用电荷超速离心获得的EV更有效668论坛★ღღღ。沉淀法避免了对昂贵设备的需求★ღღღ，适用于从小型生物样品中分离EV★ღღღ。使用硫酸铵进行盐析★ღღღ，从脱脂牛奶中分离EV★ღღღ，实现与UC相当的纯度和产量★ღღღ，而使用ExoQuick试剂盒分离的EV纯度较低★ღღღ。他们还验证了EV作为治疗载体的相关功能★ღღღ。
通过微流控芯片对EV进行分离定量★ღღღ，具有样品体积小★ღღღ、检测速度快★ღღღ、多通道检测易于实现等优点而受到广泛关注★ღღღ。设计了一种基于膜的微流控平台★ღღღ，使用两个膜过滤器进行EV分离和计数★ღღღ，用于从血液中快速分离和定量EV★ღღღ。首次使用0.2μm聚碳酸酯膜进行搅拌增强过滤以分离小型EV★ღღღ，分离率超过99%★ღღღ。氧化铝膜上的CD63免疫染色显示荧光标记的CD63+EVs★ღღღ，可在显微镜下计数★ღღღ。通过分析荧光斑点尺寸分布★ღღღ，可以估计单个EV的外泌体蛋白表达★ღღღ。创建了一个基于亲和捕获的微流体平台★ღღღ。它由两个微流体芯片组成★ღღღ：一个马蹄形口混合器（HOMM）单元和一个鱼陷阱形状的微过滤器单元（鱼陷阱）★ღღღ，分别用于捕获和洗脱纯化★ღღღ。这些芯片可以组合使用或单独操作★ღღღ，EV的捕获★ღღღ、富集和释放可以在5分钟（100μL样品）内完成★ღღღ。开发了一种用于EV分离的微流体两相水系统（ATPS）★ღღღ。ATPS装置有三个入口和三个出口★ღღღ，形成两个两相水流界面层★ღღღ，以PEG和葡聚糖ATPS为微流控通道★ღღღ。该设备可以从EVs-蛋白质混合物中回收高达83.4%的EV★ღღღ，并去除高达65.4%的杂质★ღღღ。
通过微流体分离EV是近年来发展起来的一种相对较新的方法★ღღღ。由于自动化★ღღღ、低样品要求和程序的高通量性质★ღღღ，它逐渐引起研究人员的关注★ღღღ。但是★ღღღ，需要解决有关大规模应用的问题（降低制造和操作的复杂性）★ღღღ。
基于化学亲和力的EV分离已被广泛研究★ღღღ。基于亲和力的方法可分为两大类★ღღღ：目标EV捕获和非目标EV捕获★ღღღ。为了靶向捕获EV★ღღღ，使用高亲和力抗体★ღღღ、适配体和肽的组合靶向EV表面的各种生物分子★ღღღ。同时★ღღღ，非靶向捕获使用脂质探针★ღღღ、磷脂酰丝氨酸（PS）和TiO668论坛★ღღღ。基于EV表面脂质的高亲和力提取EVku酷游平台★ღღღ。使用传统的球形免疫磁珠会导致较低的浓度和回收效率★ღღღ，因为磁珠的表面光滑和刚性界面修饰★ღღღ。一种使用脂质标记和磁珠的新技术★ღღღ，首先插入脂质基序DSPE-PEG1000-TCO★ღღღ，该基序标记血浆中的EV★ღღღ，然后使用生物正交点击化学将TCO标记的EV固定在四嗪（TZ）接枝微球（小贴）上★ღღღ。然后通过离心分离小贴纸上的EV★ღღღ，最后使用逆转录数字PCR（RT-dPCR）分析EV中的mRNA★ღღღ。与基于免疫亲和力的EVs标记不同★ღღღ，基于免疫亲和的EVs标记受EVs表面特异性抗原（CD63★ღღღ、CD81★ღღღ、CD9）数量的限制★ღღღ，基于脂质的EVs标记物独立于EVs表面抗原★ღღღ。这些标志物与RT-dPCR同时组合可以量化尤文肉瘤和胰腺癌的致癌变化★ღღღ，证明其在监测治疗反应和疾病进展方面具有潜在的临床价值★ღღღ。开发了免疫磁性刺猬颗粒（IMHP）来捕获和释放外泌体★ღღღ。这些颗粒用于从MCF-7细胞中捕获外泌体★ღღღ，捕获率高达91.7%★ღღღ。与通过UC获得的外泌体相比★ღღღ，通过该方法获得的外泌体保持了其结构完整性并显示出良好的生物活性★ღღღ。利用了富含磷脂酰丝氨酸的外泌体表面和SiO上的固定肽配体2微球诱导特异性相互作用并分离外泌体★ღღღ，并使用该方法从血清中分离外泌体668论坛★ღღღ。
使用DNA定向固定化（DDI）策略★ღღღ，通过固定与磁性颗粒上的囊泡结合的抗CD63抗体来分离EV★ღღღ。也就是说★ღღღ，使用互补寡核苷酸对表面和抗体进行功能化★ღღღ，通过双链DNA接头的DNAse I催化酶促切割释放EV★ღღღ。传统方法基于通过加热或超声波破坏抗原抗体和改变其物理性质★ღღღ，用有机溶剂★ღღღ、碱和其他化学方法处理可能会损坏EV★ღღღ。然而★ღღღ，所提出的可逆DNA连接可以允许在酶切后释放EV★ღღღ，克服这个问题★ღღღ，同时增强对抗CD63抗体的亲和力★ღღღ。基于与EVs表面的静电相互作用★ღღღ、物理吸附和生物识别相结合★ღღღ，制备了一种由乳铁蛋白偶联树枝状修饰的磁性纳米颗粒组成的嵌合纳米复合材料★ღღღ，无需离心和抗体亲和力即可分离EV★ღღღ。EV可以在30分钟内从细胞培养物和临床标本中分离出来★ღღღ，但无法与其他类型的EV区分开来★ღღღ。
使用电泳迁移和多孔膜从等离子体中分离EV★ღღღ，多孔膜由两个电极之间并列的膜形成的三个流道组成★ღღღ。样品在切向流中水平移动★ღღღ，并在施加的电压下垂直迁移★ღღღ。然而★ღღღ，尺寸30nm的带负电的EV无法通过孔并积聚在膜上★ღღღ，随后用PBS洗涤膜以收集EV★ღღღ。使用琼脂糖凝胶电泳从血浆脂蛋白中分离EV★ღღღ，该方法基于EV大小和zeta电位的差异★ღღღ。通过电泳回收的EV的形态与典型EV的形态一致★ღღღ。Naohiro一种使用阴离子交换制备外泌体的有效方法★ღღღ，其中细胞上清液首先通过0.22μm保留滤膜分离★ღღღ，然后使用阴离子交换柱层洗脱EV★ღღღ。该方法被证明最适合制备符合GMP标准的EV以供临床使用★ღღღ。
综上所述★ღღღ，目前EV分离的方法多种多样★ღღღ。但是★ღღღ，每种方法都有其优点和缺点★ღღღ。无论采用何种方法★ღღღ，重要的是考虑分离的EV是否完整★ღღღ，以及是否可以通过结合不同的技术来优化分离和纯化★ღღღ。因此★ღღღ，可以有效地分离高纯度EV★ღღღ，同时去除不需要的物质★ღღღ，确保安全并最大限度地降低成本以实现大规模运营★ღღღ。九州酷游官方网站★ღღღ，BET9亚洲第一品牌KU集團★ღღღ，